A la Table de Matières Fun Science Gallery

Tôt ou tard ce site ne serà plus accessible.
Son contenu èst disponible à la nouvelle adresse www.funsci.it où son activité aura une suite.

Comment Extraire le DNA des Fruits

G. Carboni, Septembre 2005
Traduit par Caroline Varin, Avril 2007

 


TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION
PROCEDURE
Résumé de la procédure
Opérations préliminaires
Préparation de la solution d’extraction
Préparation de la pulpe
Extraction du DNA
Filtration
Enlèvement des protéines
Précipitation du DNA
Observation avec un microscope
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

Figure 1: Tube à essais avec du DNA extrait

   


INTRODUCTION

Ces dernières années, il n’est pas rare de lire des articles sur le DNA dans des magazines tant scientifiques que populaires. Le DNA est régulièrement cités dans les informations et on y fait souvent référence dans les feuilletons scientifiques à la télévision. Le DNA, aussi connu sous le nom d’Acide Désoxyribo Nucléïque, est une longue molécule qui contient l’information génétique de tout être vivant, qu’il soit végétal, animal ou simplement un microorganisme. Il est capable de se recopier pour synthétiser de l’Acide Ribo Nucléïque (RNA). Dans les formes de vie plus évoluées ou plus complexes, le DNA est contenu dans le noyau des cellules. Excepté dans les globules rouges des mammifères, qui sont dépourvus de noyau, toutes les cellules d’un être vivant contiennent de le DNA. Les cellules de l’organisme n’utilisent q’une partie de la molécule de DNA – partie appelée gène – pour produire les protéines dont elles ont besoin pour fonctionner. Pour une description plus détaillée du DNA incluant sa structure, sa fonction et les mécanismes de production des protéines les lecteurs pourront consulter la liste de textes dans la partie bibliographie de ce document – ces textes sont bien écrits et contiennent des illustrations intéressantes. Dans cet article, je décris une expérience simple qui vous permettra d’extraire un peu du DNA de banana, bien que vous puissiez l’utiliser également avec d’autres fruits et même avec les légumes. C’est une expérience qui peut aussi bien se faire à la maison qu’à l’école.


PROCEDURE

RESUME DE LA PROCEDURE
La procédure décrite ci après exploite le fait que la membrane externe des cellules et de leur noyau sont composés de substances grasses qui peuvent être brisées en utilisant un simple détergent. La première opération de cette procédure est de broyer le fruit ou de le mixer de manière à ce que les cellules soient le plus séparées possible les unes des autres de manière à les exposer au détergent. Dans un deuxième temps, on ajoute le détergent à la pulpe du fruit de manière à libérer le DNA de les membranes qui l’enferment. Dans un troisième temps, il est nécessaire de filtrer la mixture pour séparer les acides nucléiques du reste des cellules. Finalement, le DNA précipite dans l’alcool où il devient visible. Le DNA obtenu par cette procédure peut être observe avec un microscope et peut être utilisé pour d’autres expériences comme l’électrophorèse.

 

OPERATIONS PRELIMINAIRES

MATERIEL
- pot;
- thermomètre;
- saladier en plastique;
- Glaçons;
- 50mLc de 70 - 95 % isopropyl ou alcool dénaturé (éthanol) dans une bouteille fermée;
- papier filtre ou tissu absorbant.

METHODE
- La veille de l’expérience, préparez quelques glaçons;
- au moins deux heures avant, placez dans le congélateur une bouteille étanche contenant 50 mL de 70-95% isopropyl ou alcool dénaturé. Ce récipient doit être fermé de manière étanche pour éviter que les vapeurs d’alcool ne s’échappent car elles sont inflammables;
- 15 minutes avant de démarrer la procédure, chauffez un pot d’eau du robinet à 60°C.

Figure 2 – Avant de commencer l’expérience il est
important de réaliser les étapes préliminaires décrites ici.

 

Figure 3 – Préparation de la solution extractante
(eau distillée, sel de cuisine, détergent, seringue,
bécher de 100 mL et une cuillère).

 

PREPARATION DELLA SOLUTION D'EXTRACTION

Comme mentionné précédemment, le DNA est continu dans le noyau des cellules des fruits sur lesquels nous allons travailler. Pour libérer le DNA, il va être nécessaire de briser les membranes des cellules ainsi que celles des noyaux. Comme ces membranes sont faites de phospholipides, qui sont des molécules riches en acides gras, nous allons les dissoudre en utilisant un simple détergent ménager. Nous utiliserons également un peu de sel de table, qui aide à éliminer les protéines, appelées histones, dans lesquelles le DNA est emballé.

MATERIEL:
- 100 mL d’eau distillée, mais de l’eau du robinet convient aussi;
- un système pour peser de faibles masses (si possible);
- 3 g de sel de table (une demi cuillère à café);
- 10 mL de détergent liquide;
- une seringue de 10 mL sans aiguille;
- un bécher de 100 mL;
- une baguette en verre.

METHODE
- Mettez 3 g de sel et 80 mL d’eau distillée dans le bécher de 100 mL;
- mélangez jusqu’à ce que le sel soit complètement dissout;
- avec la seringue, prenez 10 mL de détergent liquide et ajoutez le à la solution;
- ajoutez de l’eau distillée jusqu’à obtenir un volume total de 100 mL ;
- en évitant de produire des bulles, mélangez pour homogénéiser la solution.
- la solution extractante est prête.

 

PREPARATION DE LA PULPE

Cette opération cherche à séparer les cellules les unes des autres pour permettre une meilleure action de la solution d’extraction.

MATERIELS
- 100 g de banane (ou: kiwi, poire, pomme, kaki, pois, oignon, etc.);
- balance;
- couteau;
- planche à découper et une fourchette;
- bécher de 250 mL;
- cuillère à thé.

METHODE
- Placez 100 g de banane (sans la peau) sur une planche à découper et écrasez la avec une fourchette jusqu’à obtenir une purée. Si vous utilisez un oignon, avec un couteau découpez des petits cubes de 5mm de coté au maximum. Vous pouvez aussi utiliser un mixer. Si c’est le cas ne mixez pas la pulpe trop longtemps;
- placez le mélange dans un bécher de 250 mL.

Figure 4 - Préparation de la pulpe de fruit.

 

EXTRACTION DU DNA

Le but de cette opération est de rompre la membrane des cellules et de leur noyau pour libérer le DNA. La pulpe doit être chauffée à 60°C pour accélérer le processus de rupture des membranes. Chauffer la pulpe aide aussi à désactiver certaines enzymes comme la DNase qui peut dégrader le DNA. Cependant, si la pulpe est chauffée à une température trop élevée et pendant un trop long moment le DNA commence à se fragmenter en raison de son exposition à la chaleur. Pour cette raison, après 15 minutes il est judicieux de refroidir la pulpe dans un bain d’eau réfrigéré pendant 5 minutes.

Figure 5 – Placez la solution d’extraction dans la pulpe et mixez le tout.

Figure 6 – La pulpe doit être gardée à 60°C pendant un temps de 15
minutes puis doit être réfrigérée dans un bain à 0°C pendant 5 minutes.

MATERIEL
- Thermomètre;
- récipient avec de l’eau à 60°C;
- saladier avec de l’eau du robinet et des glaçons.

METHODE
- Placez la solution d’extraction dans la pulpe;
- mettez le bécher au bain marie dans le récipient contenant de l’eau à 60°C;
- mixez le mélange pour répartir la solution extractante et pour homogénéiser la température du mélange;
- après 15 minutes, placez le bécher au bain-marie dans l’eau avec les glaçons;
- remuez le mélange pour rendre la température uniforme;
- après 5 minutes sortez le bécher de l’eau froide et préparez vous pour la filtration.

 

FILTRATION

Le procédé de filtration est utilisé pour recueillir le liquide riche en AND et pour le séparer des résidus de cellules et des autres tissues qui composent le fruit, qui sera laissé de côté.

MATERIEL
- Passoire avec un diamètre de 12 cm environ;
- papier filtre pour café (le papier filtre de laboratoire est trop épais). Le papier essuie-tout de cuisine peut aussi être utilise, pourvu qu’il n’ait pas de trou visible;
- bol.

METHODE
- Placez la passoire sur un bol;
- prenez un papier filtre, pliez le, mouillez le et placez le dans la passoire;
- placez un peu de pulpe sur le filtre, en prenant soin pour qu’il reste sur le papier filtre;
- appuyez avec précaution pour aider à la filtration en évitant d’accrocher le papier filtre;
- le liquide filtré que vous obtenez est riche en DNA.

Figure 7 – Filtrez la pulpe en utilisant une
passoire, un papier filtre et un bol.

 

ENLEVEMENT DES PROTEINES (optionnel)

Avec cette opération supplémentaire il est possible d’obtenir un DNA plus pur, mais cela n’est pas essential à l’observation du DNA. Le DNA est enroulé dans des protéines appelées histones. On peut enlever ces protéines pour obtenir un DNA extrait d’une meilleure qualité. A ce but, vous pouvez utiliser des enzymes protéolytiques comme les protéases. Vous pouvez vous procurer des protéases dans des magasins qui vendent des produits chimiques, vous pouvez aussi les remplacer par une substance beaucoup plus facile à trouver. Il s'agit du jus d’ananas qui contient de la broméline, une substance capable de casser les protéines en acides aminés dont elles sont composées et donc d'en faciliter l'elimination.

Figure 8 – Obtention du jus d’ananas.

Figure 9 – dans un tube à essais placez
5 mL du filtrat et 1 mL de jus d’ananas.

MATERIEL
- Enzyme Protéolytique (ex: Protéase ou jus d’ananas);
- une seringue de 5 mL sans aiguille.

METHODE
- Dans un tube à essais, placez 5 mL de la solution filtrée;
- ajoutez 1 mL de jus d’ananas et mélangez;
- attendez 2 - 3 minutes pour laisser à la broméline le temps d’agir.


PRECIPITATION DU DNA

Le DNA est assez soluble dans l’eau où il est invisible, alors qu’il est très peu soluble dans l’alcool dans lequel il précipite et devient visible. En ajoutant de l’alcool à la solution de DNA dans le tube à essais, le DNA devient visible.

Figure 10 – Tout doucement ajoutez de l’alcool refroidi
dans le tube et évitez de mélanger l’alcool au filtrat.


Figure 11 - Tube contenant le DNA de banane avec de nombreuses
petites bulles d’air libérées par le réchauffement de l’alcool. Dans la
Figure 1, il y a moins de bulles et le DNA est observé comme une
substance laiteuse.

MATERIEL
- Quelques tubes pour l’éventuelle répétition de la manipulation;
- support pour tubes à essais;
- de l’alcool refroidi (gardé au réfrigérateur).

METHODE
- Doucement ajoutez dans le tube à essais de l’étape précédente, un peu d’alcool refroidi en évitant de remuer le filtrat;
- le volume d’alcool ajouté doit être à peu près le même que celui du filtrat;
- laissez reposer le tube pendant 5 minutes pour permettre au DNA de précipiter et de se regrouper dans le tube.

Maintenant, à l’interface entre l’alcool et le filtrat vous devrez voir une substance laiteuse, dont le volume tend à augmenter au cours du temps. Cette substance laiteuse est le DNA de banane. Malheureusement, dans cette petite masse laiteuse, vous il y a de nombreuses petites bulles. La présence de ces bulles est due au fait que la solubilité des gaz dans un liquide, augmente lorsque la température de ce liquide diminue. Quand l’alcool était dans le réfrigérateur, il a absorbé des gaz qui sont expulses quand l’alcool se réchauffe.

 

OBSERVATION AU MICROSCOPE (optionnel)

MATERIEL
- Des lames de microscope propres;
- un crochet fait avec une longue tige de métal;
- un colorant pour marquer les noyaux (ex: bleu de méthylène, Toluidine);
- compte goutte;
- microscope.

METHODE
- avec une longue tige de métal qui se termine par un crochet, extrayez un échantillon de DNA du tube et placez le sur une lame de microscope propre;
- répartissez la masse sur la lame et teignez là avec un colorant nucléaire;
- si nécessaire, ajoutez un peu d’eau et placez une lamelle par dessus.

En observant cette préparation sous un microscope, n’espérez pas observer la très célèbre structure en double hélice imbriquée du DNA. Vous ne pouvez pas la voir, même au microscope électronique. Ce que vous verrez sont des amas ou flocs de matériel DNA qui ressemble à un enchevêtrement de brins de protéines comme le montre la Figure 12.

Figure 12 – Echantillon de DNA de banana à un
grossissement de 100 (teintée avec une solution
de Toluidine à 1%).


CONCLUSION

Cette expérience n’était pas si difficile que ça à réaliser après tout, n’est ce pas? Le but de cette simple expérience était de vous initier aux procédures utilisées en biologie moléculaire. Souvent les techniques utilisées en laboratoire de microbiologie moderne repose sur des opérations simples comme celle-ci. Dans d’autres cas la procédure peut être assez complexe et peut nécessiter des manipulations et des équipements beaucoup plus sophistiqués. Dans tous les cas de grandes connaissances en biologie et en chimie sont nécessaires pour comprendre comment le DNA est utilisé dans les domaines de la biologie et de la médecine. Si cette expérience a suscité un intérêt dans la poursuite de vos explorations futures, souvenez vous que les ressources disponibles sur Internet peuvent vous conduire à de nouveaux sujets de curiosité. Si vous voulez en apprendre plus, référez vous au document [2] dans la section bibliographie de cet article. L’extraction du DNA est la première étape de beaucoup d’autres expériences fascinantes.


BIBLIOGRAPHIE

1 - Helena Curtis, N. Sue Barnes; "Biology"; Worth Publishers, Inc., New York; un texte de biologie pour grandes écoles.

2 - http://www.funsci.com/texts/wsites_en.htm Cherchez le mot: "SAPS". Vous trouverez des instructions pour faire d’autres expériences amusantes et intéressantes.

Mots clés pour Internet: DNA extraction, protéine de DNA, acides aminé, ribosomes..

 

 
 

Dites-nous ce que vous pensez du présent article.


A la Table de Matières de FSG  Au début de l'article  Télécharger l'article